Obtención y caracterización cinética y estructural de dos variantes recombinantes de ShPI-1, inhibidor de proteasas de la anémona Stichodactyla helianthus, y de sus complejos con tripsina, quimotripsina y elastasa pancreáticas

Resumen

El inhibidor de proteasas ShPI-1 es una proteína previamente aislada de la anémona Stichodactyla helianthus (Premio ACC. 1995-1996. MA Chávez y col. Stichodactyla helianthus: Fuente de polipéptidos bioactivos) que presenta características excepcionales por su capacidad de inhibir proteasas de varias clases mecanísticas. Este amplio espectro motivó el empleo del inhibidor natural en la biotecnología, para incrementar los rendimientos y estabilidad de proteínas obtenidas por vía recombinante y de los componentes de un juego diagnóstico neonatal de fibrosis quística. Estas y otras aplicaciones biomédicas potenciales determinaron como objetivos la expresión de ShPI-1 por vía recombinante y la determinación de su estructura cristalográfica, la obtención y caracterización funcional y estructural de un mutante más específico, con mayor actividad frente a enzimas tipo elastasa y la determinación de las estructuras 3D de los complejos con tres proteasas de tipo serino. Como primera etapa se abordó la obtención en Pichia pastoris, purificación y caracterización de una variante recombinante (rShPI-1A) similar al inhibidor natural y un mutante en el sitio reactivo (rShPI-1/K13L) con mayor fortaleza de inhibición de elastasa de neutrófilos humanos (ENH), diana terapéutica de enfermedades inflamatorias y respiratorias. Como resultado, se obtuvieron dos nuevas entidades moleculares derivadas de ShPI-1, con altos niveles de expresión y grado de pureza, lo que permitió demostrar su aplicación biotecnológica sin afectar la fuente natural, así como contar con un mutante más selectivo de ENH para iniciar estudios biomédicos. Como segunda etapa, se determinaron las estructuras cristalográficas del inhibidor libre y en complejos con dos proteasas de tipo serino. A partir de estos resultados se informa la primera estructura cristalográfica de rShPI-1 y las primeras estructuras
tridimensionales (3D) de complejos entre un dominio BPTI-Kunitz de un organismo invertebrado y las enzimas tripsina y quimotripsina pancreáticas. El análisis de estas estructuras demostró la conservación en anémonas de la mayoría de las interacciones enzima inhibidor descritas para mamíferos y la mayor contribución del sitio P3 (Arg11) de ShPI-1 a la fortaleza de la inhibición y estabilidad del complejo con tripsina, lo cual resulta novedoso en la familia de inhibidores BPTI-Kunitz. En una tercera etapa se determinó la estructura 3D del complejo entre el mutante rShPI-1/K13L y EPP, que constituye la primera estructura 3D informada de un complejo entre un dominio BPTI-Kunitz y una enzima tipo elastasa. El análisis de esta nueva estructura reveló la contribución de la Arg11 en el sitio P3 y su posible influencia en la selectividad frente a ENH o EPP. El impacto científico de estos resultados radica en que se describen características estructurales que contribuyen a ampliar el conocimiento de ShPI-1 y de la familia de inhibidores BPTI-Kunitz. Este conocimiento abre el camino al diseño y desarrollo de variantes más específicas frente a proteasas de interés biomédico. Los resultados están publicados en cinco artículos científicos, además de uno enviado, una tesis de Doctorado en Ciencias Biológicas, una tesis de maestría y cuatro nuevas estructuras anotadas en el banco de datos de proteínas (PDB).

Estos resultados forman parte de 13 presentaciones en 10 eventos nacionales e internacionales, un Premio Anual de Investigación Universidad de La Habana 2008 y un premio internacional al mejor trabajo en la escuela internacional de cristalización biológica, Granada, 2009.