IDENTIFICACIÓN MEDIANTE SECUENCIACIÓN PROFUNDA DEL MECANISMO DE SILENCIAMIENTO CONTRA TOMATO YELLOW LEAF CURL VIRUS EN PLANTAS DE TOMATE CULTIVADAS EN CAMPO

Resumen

El silenciamiento del ARN es un mecanismo natural que se puede emplear para generar plantas resistentes a virus. En resultados previos (Premio de la Academia de Ciencias de Cuba en el 2005 con el título “Obtención de plantas inmunes a la infección por virus con genoma de ADN mediante el silenciamiento génico post-transcripcional: Herramientas moleculares para el control y seguimiento de enfermedades causadas por geminivirus”) se demostró la inhibición de Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) en plantas de tomate transformadas con una estructura de ARN viral de doble cadena en forma de horquilla, inoculadas en casa climatizada (Fuentes y col., 2006). En el presente trabajo, nos propusimos caracterizar el mecanismo de silenciamiento viral desplegado por la horquilla así como su estabilidad y consistencia en comparación con el proceso natural contra TYLCV en condiciones de cultivo en campo. Para ello se utilizaron dos eventos-modelos, 126 y B1 en las generaciones F6 y F4 respectivamente, portadores de idéntico diseño de la horquilla pero con diferentes marcadores de selección (Fuentes y col., 2006; Fuentes y col., 2008). Ambos eventos fueron cultivados en campo y evaluados en cuanto a la severidad de los síntomas que provoca TYLCV y el nivel de replicación viral. Además, se aplicó el ensayo de Northern blot de alta resolución y la tecnología de secuenciación profunda para la caracterización del proceso de silenciamiento viral inducido y natural. Como resultado, se demostró por primera vez en condiciones de campo la efectividad y superioridad de la horquilla para la protección de las plantas de tomate contra TYLCV. Se logró distinguir el mecanismo de silenciamiento y los componentes involucrados en los eventos resistentes 126 y B1 en comparación con las plantas no transformadas de la variedad Campbell 28. Por primera vez se demostró la consistencia y durabilidad del silenciamiento inducido por la horquilla en condiciones de campo frente a TYLCV, lo cual sustenta la aplicabilidad de esta estrategia en la protección de las plantas de tomate contra este patógeno. Se evidenciaron por primera vez las probables debilidades del mecanismo natural de silenciamiento contra TYLCV y por qué la respuesta natural es insuficiente. Estos resultados permiten establecer estrategias moleculares similares para otros cultivos afectados por geminivirus y proporciona nuevas herramientas para el estudio del proceso de silenciamiento en las plantas. Los resultados de este trabajo están contenidos en dos publicaciones: “Field trial and molecular characterization of RNAi transgenic tomato plants that exhibit resistance to Tomato yellow leaf curl geminivirus”, 2016. MPMI, vol 29, N 3, pp 197209 (factor de impacto 4); y “A transformation procedure for recalcitrant tomato by addressing transgenic plant- recovery limiting factors”, 2008. Biotechnol. J., 3, 1088– 1093 (factor de impacto 3.7). El trabajo, además, está avalado por varias personalidades del ámbito científico, por la Dra. Marta Alvarez Gil (Cuba); el Dr. Basavaprabhu L. Patil (India); los Drs. John P. Carr y Dr. Steven A. Whitham (editores de la revista MPMI) y el Dr. Francisco Aragao (Brasil).